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    新闻中心

    双酶切连接反应之全攻略

    发布时间:2022-12-27浏览次数:100返回列表

    在进行PCR扩增时候,给引物两端设计好酶切位点,一般说来,限制酶的 选择非常重要,尽量选择粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶,如BamHI、HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER,以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后,在各个酶的两边加上保护碱基,其原则可参照此处。

    双酶切时间及其体系:需要强调的是很多人建议酶切过夜,其实完全没有必要,一般酶切3个小时,其实1个小时已经足够。应用大体系,如100微升。

    纯化问题:纯化PCR产物割胶还是柱式,我推荐柱式,因为割胶手法不准,很容易割下大块的胶,影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物,既然如此,酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以,PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。用的是TAKARA的纯化柱试剂盒。

    酶量的问题:以TAKARA的为例,其对1单位酶的定义如下:在50 μl 反应液中,30℃温度下反应1小时,将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。 而该酶浓度约为15单位/微升,在除外酶降解的 因素外,该酶可分解15 μg的DNA,而一般从1-4 ml菌液提出的 DNA约为3 μg,而PCR纯化后的产物(50体系)约为3 μg,所以即便全部加进去,只要纯化的 质量好,酶切完全切得动。

    1.  酶切、回收后的PCR产物与载体的连接

    摩尔比的计算,很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则 非常有必要。回收的载体片段:回收的PCR产物片段=1:10 ,一般取前者0.03 pmol,后者取0.3 pmol。

    pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA:(X pmoles×长度bp×650)/ 1,000,000 (注:长度bp×650是该双链DNA的分子量)所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1 pmol 1000 bp DNA=0.66 μg,如载体是5380 bp,则0.03 pmol为

    0.03×5.38×0.66=0.106524 μg。

    测DNA浓度可以在专用机子上测,注意OD值,一般约1.8-2.0,另外,如果嫌麻烦,也可用MARKER进行估测,如MARKER2000,5微升的 MARKER每个条带约50 ng。

    连接反应:TAKARA的 连接酶上的 说明写的过夜,而其对连接酶单位的定义为:在20 μl的连接反应体系中,6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16 ℃下反应30分钟时,有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位(U)。而它的浓度为350 U/μl ,所以完全够用。连接酶容易失活,注意低温操作,好在冰上。时间3个小时足已。

    2.  转化

    a.  全量(10 μl)加入至100 μl JM109感受态细胞中,冰中放置30分钟。

    b.  42 ℃加热45秒钟后,再在冰中放置1分钟。

    c.  加入890 μl AMP阴性培养基,37 ℃振荡培养60分钟。

    取100 μl铺板。也可离心后余100 μl。

    几个非常重要的问题

    1.  做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解,为保险起见,一般连接3小时,16度。

    2.  对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时,注意加AMP时的温度,温度过高,会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里,烤箱一般温度为55-60度,然后做的时候拿出来,这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干。

    3.  对照的设立:

    为验证双酶切是否成功,可做如下对照:

    A 酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性,如两管均成线性可初步判断双酶切成功。

    做转化时也要进行对照。

    设4个:

    A.  即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培养基、连接酶都'正常'的情况下。

    B.  酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒。

    C.  设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误。

    D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况。

    3.  所有的试剂切记低温保存

    一步一个脚印,不要偷懒,图省事后却费事,注意设立对照。

    经PCR鉴定,克隆90%-的阳性率,所以在后面的 挑克隆中,我只挑选4个就足够了。然后双酶切鉴定,测序。

    天天综合网Av
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