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双酶切连接反应之全攻略
发布时间：2022-12-27浏览次数：100返回列表
在进行PCR扩增时候，给引物两端设计好酶切位点，一般说来，限制酶的 选择非常重要，尽量选择粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶，如BamHI、HindIII，提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER，以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后，在各个酶的两边加上保护碱基，其原则可参照此处。
双酶切时间及其体系：需要强调的是很多人建议酶切过夜，其实完全没有必要，一般酶切3个小时，其实1个小时已经足够。应用大体系，如100微升。
1. 酶切、回收后的PCR产物与载体的连接
摩尔比的计算，很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则 非常有必要。回收的载体片段：回收的PCR产物片段=1：10 ，一般取前者0.03 pmol，后者取0.3 pmol。
pmol为单位的DNA转换为为μg单位的DNA：（X pmoles×长度bp×650）/ 1,000,000 （注：长度bp×650是该双链DNA的分子量）所得数值即为μg,也可以直接用这个公式套.1 pmol 1000 bp DNA=0.66 μg，如载体是5380 bp，则0.03 pmol为
0.03×5.38×0.66=0.106524 μg。
测DNA浓度可以在专用机子上测，注意OD值，一般约1.8-2.0，另外，如果嫌麻烦，也可用MARKER进行估测，如MARKER2000，5微升的 MARKER每个条带约50 ng。
连接反应：TAKARA的 连接酶上的 说明写的过夜，而其对连接酶单位的定义为：在20 μl的连接反应体系中，6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16 ℃下反应30分钟时，有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位（U）。而它的浓度为350 U/μl ，所以完全够用。连接酶容易失活，注意低温操作，好在冰上。时间3个小时足已。
2. 转化
a. 全量（10 μl）加入至100 μl JM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。
b. 42 ℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。
c. 加入890 μl AMP阴性培养基，37 ℃振荡培养60分钟。
取100 μl铺板。也可离心后余100 μl。
几个非常重要的问题
1. 做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态，因为LIGASE酶很容易降解，为保险起见，一般连接3小时，16度。
2. 对含有AMP-RESISTENCE的质粒铺板时，注意加AMP时的温度,温度过高，会使克隆株无法筛选出来.我的方法是培基高温消毒后放在烤箱里，烤箱一般温度为55-60度，然后做的时候拿出来，这样好掌握温度。铺板前后注意用吹风机吹干。
3. 对照的设立：
为验证双酶切是否成功，可做如下对照：
A 酶切反应时加各单酶分别切，两管，用同一种BUFFER，跑胶，看单切的两管是否成线性，如两管均成线性可初步判断双酶切成功。
做转化时也要进行对照。
设4个：
A. 即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应，这个对照可进一步看双酶切是否成功，如果长出克隆，说明很有可能只进行了单酶切，如没长出克隆，则证明双酶切成功,当然要保证感受态，培养基、连接酶都'正常'的情况下。
B. 酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化，这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒。
C. 设原始质粒为对照，意为检测整个操作过程中是否有误。
D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够，检测感受态状况。
3. 所有的试剂切记低温保存
一步一个脚印，不要偷懒，图省事后却费事，注意设立对照。
经PCR鉴定，克隆90%-的阳性率，所以在后面的 挑克隆中，我只挑选4个就足够了。然后双酶切鉴定，测序。
